В патофизиологии сердечно-сосудистых заболеваний одно из ключевых мест занимает гипоксия, так как при этом происходит нарушение газотранспортной функции крови и, во многих случаях, снижение эффективности переноса кислорода эритроцитами. Одной из важных причин нарушения кислородтранспортной системы может быть изменение конформации гемопорфирина гемоглобина (Hb) и его сродства к кислороду (О2). Изменение конформации гемопорфирина и О2-связывающих свойств гемоглобина исследовали методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Исследование выполнено на рамановском спектрометре in via Basis фирмы Renishaw с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм). Для возбуждения рамановских спектров использовался лазер (длина волны излучения 532 нм, мощность излучения 100 мВт, объектив 100х). Регистратор данных – CCD детектор (1024×256 пикселей с пельтье–охлаждением до – 70 °С) с решеткой 1800 штр/мм. Оцифрованные спектры обработаны в программе WIRE 3.3. Произведена коррекция базовой линии, сглаживание спектров. В данной работе для анализа конформации гемопорфирина гемоглобина (Hb) использовали характерные полосы спектра КР (указаны положения максимумов): 1172, 1355, 1375, 1548–1552, 1580–1588, 1618, 1668 см–1. Функциональную активность красных кровяных клеток определяли по содержанию эритроцитов, среднему объему эритроцита (MCV) и средней концентрации гемоглобина (MCHC) в клетках. Как показали наши исследования в крови практически здоровых людей (n = 9) содержание эритроцитов в пределах 4,57 ± 0,09·1012, средний объем эритроцита, и средняя концентрация гемоглобина в клетках составляет соответственно 94,3 ± 2,24 fl и 316,2 ± 2,04 г/л. У больных инфарктом миокарда (n = 10) в эритроцитах средняя концентрация гемоглобина в клетках в пределах нормы и составляет 312 ± 1,6 г/л. У всех обследованных наблюдается разный объем клеток: у 67 % показатель MCV в пределах 80–100 fl, эритроциты характеризуются как нормоциты, 33 % – объем эритроцитов больше 100 fl (макроциты). В эритроцитах наблюдаются изменения в соотношении интенсивности полос КР спектров. Так, отношение интенсивностей I1355/I1550, отражающее относительную способность всего гемоглобина в пробе связывать лиганды (в т.ч. кислород), увеличивается на 13,0 %. Интенсивность соотношения полос спектров (I1355/I1550)/(I1375/I1580), отражающее сродство гемоглобина к лигандам, в первую очередь, кислороду увеличивается на 22,0 %. Отношение интенсивностей I1618/I1580, характеризующееся содержанием комплексов Hb с NO, при наличие связи между атомом Fe2+ и глобином, составляет 0,36±0,06 отн. ед., что выше контрольных значений на 53 %. Сравнительная статистическая оценка функциональной активности эритроцитов крови позволила установить тесную корреляционную связь между объемом эритроцитов и сродством гемоглобина к лигандам (r = 0,67; р
Сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза, в первую очередь, ишемическая болезнь сердца (ИБС) остаются одной из главных проблем здравоохранения индустриально развитых стран, в том числе России. Важно выделить ведущее патогенетическое звено, которое становится определяющим для фармакологической коррекции. Всемирная ассамблея ООН в 2002 году приняла программу по исследованию старения в XXI веке. Биохимические исследования с участием зрелых, средних, пожилых и старых людей признаны необходимыми для выявления факторов, маркеров риска и подходов к адекватной терапии возраст-ассоциированных заболеваний, разработки стратегии увеличения продолжительности жизни и улучшения ее качества в пожилом и старческом возрасте, поиска предикторов потенциального возраста дожития, а также для развития фундаментальных представлений о самом феномене старения.
Одной из актуальных задач является исследование особенностей стабильности и структурного состояния мембран в старших возрастных группах населения. С нарушениями липидного гомеостаза сопряжены атерогенез и высокий риск развития сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. По мере увеличения возраста риск развития этих заболеваний нарастает. Пожилой возраст в целом характеризуется полиморбидностью; наиболее серьезными проблемами этой возрастной группы являются артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона.
Целью исследования явилось исследование стабильности и структурного состояния мембран эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца разного возраста.
Материалы и методы исследования
Проведено клинико-лабораторное обследование 70 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) различного возраста, проходивших лечение в отделении кардиологии Больницы скорой медицинской помощи №2 г. Ростова-на-Дону. Исследование проводили в трех возрастных группах. I группа — больные зрелого возраста(от 35 до 45 лет), II группа — больные среднего возраста(от 45 до 55 лет), III группа — пациенты пожилого и старческого возраста (от 55 до 75 лет).
Интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) оценивали по содержанию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Содержание первичных молекулярных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов (ДК) — определяли методом УФ — спектрофотомерии при максимуме поглощения 232 нм [14]. Содержание вторичного продукта ПОЛ — малонового диальдегида (МДА) — определили спектрофотометрически по образованию окрашенного триметинового комплекса МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой [14]. Конечные продукты ПОЛ — шиффовы основания — определяли спектрофлуориметрическим методом [15].
Структурное состояние мембран эритроцитов определяли с помощью флуоресцентного зонда пирена [2]. Микровязкость липидной фазы и зон белок-липидных контактов определяли методом латеральной диффузии зонда пирена в суспензии эритроцитов при концентрации белка 0,5 мг/мл и конечной концентрации зонда 8 мкМ.
Интенсивность флуоресценции измеряли на сперктрофлуориметре Hitachi 650-60 (Япония). Коэффициент эксимеризации пирена FЭ/FM, равный отношению интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров пирена, находится в обратной зависимости от скорости латеральной диффузии зонда в липидном слое мембран. В вязкой среде степень эксимеризации пирена снижается, поэтому коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от относительной микровязкости [2]. Микровязкость липидного слоя эритроцитарных мембран оценивали при длине волны возбуждения 334 нм, а микровязкость зон белок-липидных контактов при максимуме возбуждения света 282 нм, максимумы длин волн флуоресценции составляли для мономеров пирена — 393 нм, для эксимеров — 470 нм.
Эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен оценивали по тушению флуоресценции суспензии эритроцитов при длине волны возбуждения 282 нм и длине волны флуоресценции 330 нм в отсутствие пирена и после инкубации с зондом.
Эффективность переноса энергии определяли по выражению:
где F0 — интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов в отсутствие пирена; F — интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов после инкубации с пиреном (8 мкМ).
Полярность липидного бислоя и зон белок-липидных контактов мембран эритроцитов оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух мономерных форм F372/F393 в тонкой структуре пирена при длинах возбуждения 334 и 282 нм соответственно [5]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Как показывает проведенное исследование, в эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп наблюдается повышение содержания молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (табл. 1). Уровень первичных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах возрастает на 64, 34 и 18 % в 1-3-й группах больных ИБС. Содержание промежуточных и конечных продуктов — малонового диальдегида (МДА) и шиффовых оснований (ШО) — увеличивается на 24-31 % во всех трех клинических группах пациентов, по сравнению с донорами соответствующего возраста. Как следует из полученных результатов, у больных ИБС наблюдается интенсификация как начальных, так и конечных стадий ПОЛ в мембранах эритроцитов с образованием разнообразных продуктов, вызывающих окислительное повреждение всех биомолекул и клеточных структур организма [3].
Наибольшим цитотоксическим потенциалом обладают продукты ПОЛ типа МДА, которые относятся к поперечносшивающим бифункциональным реагентам и способны взаимодействовать с различными аминосодержащими соединениями, приводя к нарушению их структуры и функции. Конечные продукты ПОЛ — ШО — являются трудно обмениваемыми и, накапливаясь, могут инактивировать мембранные белки-ферменты, ионные каналы, рецепторы, сигнальные G-белки, вызывать нарушение структурного состояния мембран и способствовать апоптозу или некрозу клетки.
Следует отметить, что в эритроцитах доноров с увеличением возраста повышается уровень ДК и МДА во 2-й и 3-й группах, а содержание ШО возрастает в эритроцитах только в группе пожилого и старческого возраста, по сравнению с 1-й группой. Это согласуется с исследованиями [11], свидетельствующими о повышении интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) по мере старения. Повышение уровня ПОЛ в мембранах эритроцитов больных ИБС может быть причиной нарушения их стабильности и повышения проницаемости, а это снижает эффективность функционирования эритрона и ухудшает реологические свойства крови. В исследовании [6] показано, что липопероксидация в мембранах эритроцитов сопровождается выраженными морфологическими трансформациями клеток — везикуляцией, агрегацией, формированием эхино- и стоматоцитов, сложными изменениями структуры плазматической мембраны и гиперполяризацией.
Таблица 1 Содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах больных ИБС различных возрастных групп
В статье представлены материалы, результаты которых обосновывают возможность использования двух моделей простой линейной регрессии для оценки реактивных свойств сосудистого эндотелия и эритроцитов в условиях окклюзии плечевой артерии у клинически здоровыхлиц и больных ишемической болезнью сердца , осложненной стенокардией напряжения II-III функционального класса
The article presents the results of the study which substantiate possibility of using two models of simple linear regression for evaluation of reactive features of vascular endothelium and erythrocytes at occlusion of brachial artery in clinically health people and in patients with coronary heart disease complicated by exertional angina of II-III functional class
Ю.и. Пивоваров, Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова, л.Б. Корякина, Т.Е. Курильская
оценка реактивных свойств сосудистого эндотелия и эритроцитов у вольных ишемической болезнью сердца
НЦРВХ СО РАМН (Иркутск)
В статье представлены материалы, результаты которых обосновывают возможность использования двух моделей простой линейной регрессии для. оценки реактивных свойств сосудистого эндотелия и эритроцитов в условиях окклюзии плечевой артерии у клинически здоровых лиц и больных ишемической болезнью сердца, осложненной стенокардией напряжения II—III функционального класса.
Ключевые слова: ишемическая болезнь сердца
EVALUATiON OF REACTiVE FEATURES OF VASCULAR ENDOTHELiUM AND ERYTHROCYTES iN PATiENTS WiTH CORONARY HEART DiSEASE
Yu.I. Pivovarov, E.E. Kuznetsova, V.G. Gorokhova, L.B. Koryakina, T.E. Kurilskaya
SCRRS SB RAMS (Irkutsk)
The article presents the results of the study which, substantiate possibility of using two models of simple linear regression, for evaluation, of reactive features of vascular endothelium, and erythrocytes at occlusion of brachial artery in clinically health, people and in patients with, coronary heart disease complicated, by exertional angina of II—III functional class.
Key words: coronary heart disease
Известные способы оценки состояния реактивности организма, как на системном [3, 16], так и на клеточном уровне [9] в целом адекватно отражают состояние центральных и периферических механизмов адаптации к факторам окружающей среды. Однако степень сохранности таких механизмов при дополнительных нагрузках на организм до сих пор определяется либо полуколичественными методами, либо с помощью описания специфического набора тех или иных признаков адаптации.
Между тем, решение этой проблемы остается актуальным, особенно при измененной индивидуальной реактивности организма в условиях патологии, и имеет большое значение для практической медицины.
В связи с этим в задачу настоящих исследований входило установить параметры и критерии состояния реактивности на примере реакций сосудистого эндотелия и эритроцитов у больных ИБС в условиях переходных процессов, которые развивались при временной окклюзии плечевой артерии.
объем и методы исследования
Было обследовано 58 пациентов с диагнозом ИБС, имеющих стенокардию напряжения II —III функционального класса по NYHA, в возрасте от 46 до 71 года (55 ± 1,3). Всем пациентам проводилась стандартная терапия, включающая в себя вазоактивные препараты и дезагреганты. Группу сравнения составили 17 практически здоровых доноров (33,2 ± 0,55).
Функциональное состояние сосудистого эндотелия оценивали путем изучения у пациентов характера поток-индуцированной вазодилатации, уровня метаболитов оксида азота, характера про-
стациклиновой активности, уровня фактора Вил-лебранда и эндотелина-1.
Потокиндуцированную вазодилатацию исследовали ультразвуковым методом с помощью мультичастотного линейного датчика 5 — 10 МГц по методу О. Се1егта]ег с соавт. [4]. Наряду с измерением диаметра плечевой артерии (на границе интима-медиа) рассчитывали объемную скорость кровотока: О = пг2ТАУ (ТАУ — средняя интегральная скорость, г — радиус сосуда) и напряжение сдвига в плечевой артерии:
Ответную реакцию эритроцитов на окклюзионную пробу оценивали по характеру структурнофункциональных изменений (СФП) в мембране этих клеток, выявленных спектрофотометрическим методом [8, 13].
Для этого определяли:
• мембрансвязанный гемоглобин (мсНЬ) в структурных фрагментах мембраны эритроцитов до и после центрифугирования при длине волны 536 нм [17].
• суммарное содержание средне — и низкомолекулярных метаболитов (СНМ — 210—230 нм) и окисленных адениловых нуклеотидов (оНукл — 270 нм) в супернатанте после гемолиза эритроцитов и осаждения суспензии трихлоруксусной кислотой [5, 12].
Кроме того, в суспензии эритроцитов исследовали содержание метгемоглобина (метНЬ) при длине волны 630 нм [12] для косвенной оценки выраженности ишемии при окклюзионной пробе.
Все указанные параметры определяли до и после окклюзионной пробы, которая вызывалась путем накладывания манжеты сфигмоманометра на плечо пациента и создания в ней давления, превышающего систолическое на 10 мм рт. ст. в течение 5 минут. Кровь в исходном состоянии забирали из контралатеральной кубитальной вены, а после окклюзии из вены ишемизированной конечности. При этом анализу подвергались только данные, отражающие отношение изучаемого параметра (П) после окклюзии к величине этого параметра до окклюзионной пробы (8П):
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что увеличение напряжения сдвига на сосудистую стенку, в том числе, вследствие увеличения объемной скорости кровотока после прекращения временной окклюзии артерии, приводит к расслаблению ее гладкой мускулатуры. Многочисленными экспериментальными исследованиями показано, что такая реакция резистивных сосудов связана только с активацией сосудистого эндотелия [20] и поэтому была названа, как эндотелий-зависимая вазодилатация (ЭЗВД). Доказано, что повышение напряжения сдвига на эндотелии сопровождается продукцией этими клетками ряда факторов, среди которых оксид азота и простациклин играют ведущую роль в релаксации гладкой мускулатуры [10, 16, 20].
Из приведенных на рис. 1 диаграммах видно, что сразу после окклюзии плечевой артерии у пациентов обеих групп развивалась ЭЗВД. При этом величина прироста диаметра плечевой артерии у пациентов с ИБС и доноров не имела существенного различия, несмотря на то, что у больных она была на 30 % ниже, чем у здоровых лиц.
У доноров вазодилататорная реакция плечевой артерии сопровождалась падением уровня Энд-1 в крови и снижением синтеза эндотелиальными клетками ф.Виллебранда, увеличением содержа-
рис. 1. Сравнительные данные отклонения функциональных показателей сосудистого эндотелия (5П) при окклюзии плечевой артерии у доноров и пациентов с ИБС. Здесь и далее результаты представлены в медианах и процентилях (25% — 75%); p — в сравнении с донорами (Манн-Уитни).
ния мN0 и повышением простациклиновой активности эндотелия. В то же время постокклюзионная реакция сосудистого эндотелия у больных ИБС характеризовалась обратной закономерностью: повышением уровня Энд-1 и ф.Виллебранда, падением содержания мN0 при неизменном уровне простациклиновой активности эндотелия.
Полученные факты свидетельствовали о том, что индуцированная потоком дилатация плечевой артерии в целом у больных ИБС, в отличие от здоровых лиц, не приводила к усилению выработки эндотелием вазодилататоров, а напротив происходило нарастание факторов, вызывающих спазм гладкой мускулатуры (Энд-1) или способствующих вазоконстрикции. Можно предоложить, что одним из таких способствующих факторов является ф. Виллебранда, поскольку в наших исследованиях обнаружено, что уровень данного фактора сопряженно повышался на фоне падения концентрации метаболитов оксида азота (8Вбр;8мNO: г2 = 0,40; г = -0,63, р = 0,012).
В связи с тем, что у обеих групп пациентов была выявлена различная направленность метаболических реакций сосудистого эндотелия, мы допустили, что такая же закономерность в продукции вазомоторных факторов будет проявляться и при изменении уровня напряжения сдвига на сосудистую стенку.
8 mNO + 8 Прост 2
Результаты проведенного анализа показали, что у здоровых лиц усиление эндотелием продукции вазодилататоров и одновременное торможение выработки вазоконстрикторов были действительно связаны с повышением напряжения сдвига на сосудистую стенку плечевой артерии, которое развивалось сразу после временной окклюзии сосуда (рис. 2). У больных ИБС такой закономерности выявить не удалось: продукция сосудистым эндотелием вазомоторных факторов была плохо связана с отклонениями уровня напряжения сдвига, что подтвердило наличие у данной категории больных
выраженной эндотелиальной дисфункции резистивных сосудов. Неслучайно у пациентов с ИБС изменения диаметра плечевой артерии (8Д.п.а.) при окклюзионной пробе также не были согласованы с изменением напряжения сдвига — 8т (г2 = 0,002; г = 0,046, р = 0,7), в то время как у доноров эта сопряженность была достаточно высокой (г2 = 0,53; г = 0,73, р = 0,0009).
Исследование характера структурно-функциональных отклонений в мембране эритроцитов в условиях окклюзионной пробы не выявило различия в изменениях изучаемых показателей у доноров
Загрузка...